何晋月  孙靖  路康  周跃  潘勇

目的 探索张力性刺激对人椎间盘髓核细胞分泌软骨层间蛋白（cartilage intermediate layer protein，CILP）的影响及其机制。

方法 选取2016年6月在我院因创伤性骨折行L4/5椎间盘摘除及相邻椎体融合手术的1例38岁男性患者的髓核组织作为细胞来源，术前MRI示该节段椎间盘组织改良Pfirrmann分级为Ⅱ级，分离培养其中的髓核细胞并传代至第3代，进行力学实验。使用Flexcell 5000系统通过电脑控制气压变化来使载有细胞的塑料膜发生形变，进而对膜载体上的细胞给予不同强度、时长的张力性力学加载。实验组分为4组，均以10%的拉伸量为刺激强度，给予不同时长（6h、12h、24h 、48h）的刺激，空白对照组不给予任何刺激。利用RT-qPCR技术检测各组CILP的基因表达量，选出表达变化最为明显的一组，以该组的刺激时长为限，再将实验组分为3组，分别给予不同刺激强度（5%、10%、20%）的张力刺激，空白对照组不给予任何刺激，利用RT-qPCR技术检测各组CILP的基因表达。选取相比较于对照组CILP增长效应最明显的力学强度和时长作为刺激条件，测定髓核细胞在该实验条件下smad3的磷酸化程度，并对髓核细胞预先给予smad3磷酸化的特异性抑制剂SIS3处理后再置于同一力学条件下，以RT-qPCR检测CILP的基因表达量，以此观察smad信号通路是否介导了张力性刺激对于髓核细胞CILP表达的调控。实验结果使用配对t检验以及单因素方差分析进行组间比较。

结果 RT-qPCR结果显示，相较于空白对照组，不同刺激时长的10%张力性刺激均明显下调了CILP的表达，其中在刺激48h后对CILP的抑制效应达到最大（P<0.05）；5%的张力性刺激48h后髓核细胞的CILP基因相对表达量与对照组比较无统计学差异（P＞0.05），10%的张力刺激48h明显降低CILP的表达（P<0.05），20%的张力刺激48h显著提高CILP表达量（P<0.05）且smad3的磷酸化水平相对于空白对照组明显增高；相对于只给予20%张力刺激的对照组，先给予SIS3预处理再给予相同力学刺激的实验组的CILP表达水平显著下调（P<0.05）。

结论 张力性刺激调控髓核细胞的CILP表达，调控效应随着刺激时长和刺激强度的变化而不同；smad信号通路参与高强度的张力性刺激对CILP的上调效应。