伍耀宏   徐宝山   杨强   李秀兰   张杨  马信龙  夏群   张春秋  许海委   曾超

目的体外评估PKH26标记对山羊髓核细胞生物学功能的影响，并结合活体荧光成像系统评价种子细胞在裸鼠体内的生物学行为。 方法取1岁龄山羊椎间盘分离髓核组织，通过酶消化法获取原代细胞，倒置相差显微镜下观察，传代获取第1代髓核细胞，行PKH26荧光标记，荧光显微镜下观察标记后的细胞荧光强度，并行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色观察，锥虫蓝染色比较标记前后细胞活性，MTT法检测标记前后细胞增殖特性，实时荧光定量PCR检测细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达。将标记后的髓核细胞接种至一体化纤维化-髓核支架的髓核部分，纤维环部分作为阴性对照，体外培养3 d后植入5只6周龄雄性裸鼠体内，培养6周后活体成像技术检测髓核细胞-支架复合物在体内的荧光强度及范围。结果 倒置相差显微镜观察示原代髓核细胞簇状生长，呈卵圆形，第1代髓核细胞呈类软骨样细胞形态；标记后的第1代髓核细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色均呈阳性；标记后荧光强度均匀，标记前后细胞活性均在95%以上；标记前后细胞生长曲线比较差异无统计学意义（P > 0.05）；实时荧光定量PCR检测示标记前后细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因相对表达量差异均无统计学意义（P > 0.05）。活体成像技术显示体内髓核支架有强烈荧光，纤维环支架未见荧光。结论 PKH26标记对髓核细胞的活性、增殖及细胞表型的表达无明显影响，结合体内活体荧光成像系统可以追踪细胞在体内的生物学行为。