吴剑宏   阮狄克   王德利   张超  何勍   王超锋   张燕   辛洪奎   顾韬   徐成   刘玥

【摘要】 目的：研究重组腺相关病毒介导人端粒酶逆转录酶基因（recombinant adenoassociated virus vector-me?鄄diated human telomerase reverse transcriptase，rAAV-hTERT）转染对体外培养人髓核细胞功能的影响。方法：利用机械与酶消化的方法获得均一性的人椎间盘髓核细胞，将构建好的rAAV-hTERT转染P2代体外单层培养的髓核细胞。用重组腺相关病毒-增强型绿色荧光蛋白（recombinant adenoassociated virus vector-mediated enhanced green fluorescent protein, rAAV-EGFP）作为标记基因观察细胞转染效率，按感染复数（multiplicity of infection, MOI）103、104、105病毒基因组拷贝数/细胞（vector genomes/cell，v.g/cell）设组，流式细胞仪检测，筛选病毒转染的最佳MOI；设立rAAV-hTERT转染组、AAV空病毒转染组及空白细胞对照组，用反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reareaction, RT-PCR）及免疫印迹（Western-blot）方法检测rAAV-hTERT转染后hTERT基因在髓核细胞内的表达，实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR）及酶联免疫法（enzyme linked immunosorbent, ELISA）检测髓核细胞合成Ⅱ型胶原及蛋白多糖能力的变化。结果: rAAV-EGFP转染细胞后第7天时，MOI为105 v.g/cell组转染效率可达73.9%，明显高于MOI 103、104 v.g/cell组（P<0.05）；rAAV-hTERT转染组在转染后的第7、60、90、120天均可检测到hTERT基因的表达，而其他两组则无表达；转染rAAV-hTERT后120d之前，rAAV-hTERT转染组分泌蛋白多糖及Ⅱ型胶原较其他两组均明显增高（P<0.05），而两对照组之间则始终无明显差异（P>0.05）。结论：rAAV-hTERT能成功转染人椎间盘髓核细胞并正确表达，rAAV-hTERT转染能有效延长髓核细胞分泌Ⅱ型胶原及蛋白多糖功能。