卢世璧 解放军总医院全军骨科研究所

研究背景：自体软骨细胞移植技术（ autologous chondrocyte implantion ACI）和十九世纪早期出现的组织工程表明了软骨修复是可能的，从而出现了许多的修复或者替代损伤软骨的方法。在众多的方法中，将种子细胞培养在生物材料支架上然后移植到缺损部位，形成新的软骨组织，经过重塑形并与机体组织整合在一起，是软骨组织工程修复软骨损伤的基本方式，而将软骨细胞复合到一个三维的，多孔的支架上形成软骨组织是关键内容。组织工程支架的生物学、生物化学、力学以及结构特性都是非常重要的。支架材料除了提供工程化软骨样组织的三维几何形状，还为细胞提供了生存的微环境（人造临时细胞外基质），支持细胞的粘附、增殖、分化并昀终形成新的软骨组织。软骨组织工程支架的特性与天然关节软骨细胞外基质的特性相似程度越高，越有利于成功构建组织工程软骨。当然，完全具有软骨细胞外基质的各种特性的支架是不可能的也没有意义的。实际上，研究表明，天然的软骨组织并不是软骨组织工程应用的理想的支架，因为成熟的软骨组织没有高度的相互联通的孔隙结构以利于快速的、均刀的细胞分布。因此，理想的软骨组织工程支架仍是人工设计、具有天然软骨细胞外基质的某些特性的支架。我们前期研究工作将关节软骨湿法粉碎，获得天然软骨细胞外基质材料，其在生化组成上完全类似于天然关节软骨细胞外基质，再利用冷冻干燥技术，制备出适宜于软骨组织工程需要的多孔海绵样结构支架，体外实验及犬关节软骨损伤修复动物实验研究均取得了良好的效果。然后，在此基础上，我们再从天然关节软骨细胞外基质的各向异性的力学结构特性出发，拟从结构上仿生天然关节软骨细胞外基质，制备从生化组成及结构特性上仿生的软骨组织工程支架。

本研究的目的是进一步完善提取天然软骨细胞外基质材料的工艺和流程，利用天然软骨细胞外基质材料制备软骨组织工程取向性支架、从生化组成及结构特性上仿生天然关节软骨组织的特点，对其理化性质进行检测，并探讨其对种子细胞生物学行为的影响以及与自体骨髓基质干细胞复合修复兔膝关节全层关节软骨缺损的效果。

方法：（1）将天然猪软骨超微湿法粉碎，充分稀释后利用差速离心及有机溶剂沉淀的方法收集无细胞的软骨细胞外基质纳米纤维材料，化学方法交联，得到软骨细胞外基质来源的三维多孔定向取向支架（oriented scaffold，OS），及非取向三维多孔支架（ nonoriented scaffold，NOS）。

（2）分离培养兔关节软骨细胞接种在支架上体外培养，评价两种支架对负载软骨细胞的生物学行为的影响。

（3）将兔软骨细胞复合关节软骨细胞外基质源性取向和非取向支架，植入裸鼠背部皮下，进行组织学检测，评价两种支架异位成软骨的能力。

（4）抽取自体骨髓分离、培养、扩增骨髓基质干细胞（ BMSCs），进行软骨诱导 1w后，体外观察 BMSCs在两种支架上的分布排列方式。在兔膝关节髌股关节沟造一直径 4.0mm，深及软骨下骨的全层软骨缺损，分别植入取向支架加自体 BMSCs（组 1），非取向支架加自体 BMSCs（组 2），空白取向支架（组 3），空白非取向支架（组 4），旷置空白缺损（组 5）；分别在 3，6，12月取材，从修复组织的大体，组织学，生物化学等方面进行评估。

结果：（1）结果表明支架保留了大部分的细胞外基质成分；扫描电镜结果显示取向支架具有平行排列的柱状的孔道结构；孔径（ 100～200μm）和孔隙率（ ≥95％）均满足软骨组织工程需要；吸水性能（吸水膨胀率 ≥96%）良好。

（ 2）取向支架的纵向压缩模量（ 2.02±0.02MPa）远大于横向上的压缩模量（0.36±0.02MPa），非取向支架的压缩模量（ 1.07±0.05 MPa）介于取向支架的纵向和横向压缩模量之间，但远小于取向支架的纵向压缩模量。取向支架纵向上拉伸模量（22.10±0.67MPa）也远大于非取向支架的拉伸模量（5.104±0.45MPa）。差异具有统计学意义（ p＜0.05）。

（3）组织学、倒置显微镜、扫描电镜观察显示细胞在两种支架上均能良好粘附、增殖。结果显示取向支架上软骨细胞增殖明显比在非取向支架上快，差异具有统计学意义（ p＜0.05）。细胞在取向支架内部的数量明显比非取向支架多。

（4）大体观察及组织学结果显示兔软骨细胞复合取向支架及非取向支架在裸鼠皮下均能构建类软骨组织，在取向支架中，种子细胞沿着支架的孔道结构排列形成柱状排列的类软骨样组织，而在非取向支架中则呈无序的随机排列。

（5）经 PKH26荧光标记，可见 BMSCs在取向支架内部也是沿着支架孔道结构分布排列，电镜结果也证实这一点，组织学结果表明蕃红花 “O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。在修复兔膝关节骨软骨缺损的实验中，组织学评分表明 BMSCs复合取向支架和非取向支架组结果均优于空白支架和空白旷置组，差异具有统计学意义。细胞复合取向支架优于非取向支架组，差异具有统计学意义。

结论：

利用差速离心方法可以有效去除湿法粉碎后关节软骨细胞