基因研究方法浅析——我们谈谈套路

2017-09-25   文章来源:中国医学科学院北京协和医学院 北京协和医院骨科 陈崇 余可谊 沈建雄    点击量:6 我要说

引言:

生命科学研究中有很大一部分集中于基因及其产物的功能研究。事实上有哪些方法可以用于研究基因的功能呢?受益于先前的网文《基因研究的“七大绝招”和“三板斧”》,在此基础上,结合自身的一些基因研究经验,整理了新的基因研究套路,共包括七个,作者用容易记忆的成语作为标题,语言生动诙谐,希望能帮助临床医生理解基因研究方法,在设计实验时更容易,看文献听学术报告也更轻松,可谓用心良苦。

纲要:


本文主要从研究背景、研究方法和经验总结三个部分来阐述。

研究背景主要从基因研究的主要任务和当前的新热点、新任务着手,立足于基因研究的未来发展。

研究方法中结合前人的分析和总结之余,引用中国传统文化中的成语或是短语,进行概括、举例。

就我理解而言,生物学、现代医学等虽然是西方文明的产物之一,但是从哲学层面上而言,与中国的古典传统文化中,有着深刻的内在联系,我认为这种中西方、古典与现代的结合,本身就洋溢着智慧的火花,是一种美学的体现。

研究背景:


以往的基因研究的主要目的是寻找基因型与表型的内在联系,但是此方法对于单基因病和较为明确变异的疾病较为合适,而如今,更多的疾病的研究是涉及多基因和复杂因素的,其中调控因素对发病机制又占据了重要比重,使得原本就非常复杂的多基因疾病变得更为晦涩。

当前基因研究已近进入到后基因组时代,所谓后基因组学(postgenomics),又称为功能基因组学(functionalgenomics),它利用结构基因组所提供的信息和产物,发展和利用新的实验手段,通过在基因组和系统水平上全面分析基因的功能,使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。

说到后基因组时代,必须先明白后基因组学这个概念。这是在基因组静态碱基序列弄清楚之后转入对基因组动态的生物学功能研究。研究内容包括基因组发现、基因表达分析及突变检测。而后基因组时代指的就是生物界,特别是从事分子生物学的科学工作者,将研究方向向功能基因组方向转移的时代趋势。

除此之外,多位组学的兴起,主要包括基因组学(Genomics),蛋白组学(Proteinomics),代谢组学(Metabolomics),转录组学(Transcriptomics),脂类组学(Lipidomics), 免疫组学(Immunomics),糖组学(Glycomics )和 RNA组学(RNomics)学等,给我们的基因研究工作提供了新的思路和切入点。


研究方法:

1.“天时地利人和”

“天时,地利,人和”,出自《孟子·公孙丑下》“天时不如地利,地利不如人和。”

基因的表达具有时空特异性,也具有物种特异性,“天时”指基因及其产物在什么时候表达,是在胚胎期,还是青少年期间,亦或是老年阶段?

“地利”指的是基因及其产物表达于什么细胞、组织或器官,组织特异性问题是一个非常值得关注的问题。

“人和”指的是物种特异性,在人身上表达的基因,在大鼠、小鼠或是斑马鱼身上,是否有同源或相似功能的基因,这些基因的保守性如何?

三个常用数据库,会使基因研究十分得心应手,它们分别是:GeneCards、UCSC、Ensemble,它们的信息彼此之间有相互重复的地方,但是本身也具有自己的特点。


对于组织特异性问题,举个例子,比如我们在Genecards数据库进行TBX6基因的检索,在Gene Expression中,可以查到相关表达谱情况,作为骨科的基因研究,对骨骼、软骨、肌肉、神经、骨髓等组织的表达,应该予以高度重视。


对于物种特异性,在UCSC或者Ensemble数据库中都可以进行查询和比对,针对我之前所在课题组所发表的一篇文献研究,对MAPK7基因进行物种间的同源性问题进行比对,发现该基因在物种间的同源性很高,即基因的保守性高。[1]通常来说,基因承受着遗传压力,其保守性越高,功能性就越强。


(Gao W, Chen C, Zhou T, et al.Hum Mutat. 2017 Jul 17.)

2.“内外兼修”

“内外兼修”思想源于道家学派,通常也指人的修养从内外两个层面所进行的全面提升。道教不仅主张修炼形神、内丹和外丹的炼养,同时也十分强调提高个人内在的道德修养。

武侠小说中也指练武之人,修炼内功,也修炼外功,内功如九阳神功之类注重内力的提升,例如气的修炼,外功指拳脚功夫,注重一招一式,以及肌肉力量,骨骼强度的修炼,所谓“内练一口气,外练筋骨皮”。

在基因研究中,同样有类似思想,既要注重体外功能的研究,也要注重体内功能的探索,只有达到内外相应、内外一致,才能丰富、丰满基因的研究工作。


(Gao W, Chen C, Zhou T, et al.Hum Mutat. 2017 Jul 17.)

既要有细胞模型的分子机制的探索,也要有动物模型的构建,体内功能与体外机制相互呼应,会给研究工作加分!

3.“患得患失”

患:忧患,担心。担心得不到,或者对得到的东西担心失去。形容对个人得失看得很重。后引申为一味担心得失,斤斤计较个人的利害。

“患得患失”出自《论语·阳货》:“子曰:‘鄙夫,可与事君也与哉?其未得之也,患得之;既得之,患失之。苟患失之,无所不至矣!’” 意思原本指孔子说: “可以跟品质低下的人一起侍奉君主吗?当他没有得到的时候,虑患不能得到;当他得到以后,又虑患失去。如果虑患失去,那就没有什么事情做不出来了。”

那我们引申在基因研究中,可以理解为:“得”指的是基因的过表达(Overexpression);“失”指的是基因敲除(Knockout)或者低表达(Under-expression)。基因过表达或敲低或抑制基因表达,是基因研究的常用方法之一。

某一个疾病或表型,往往不是由单一基因或者说单一因素导致的,因此,基因的过表达或敲除/敲低,往往起到一种人为的放大作用,类似于数学中的“极限法”,希望看看在某种“极限”或“极端”情况下,其功能与机制发生了怎么样的变化。

有学者认为“斤斤计较”也不可忽视,无论是敲除还是过表达,其敲除或过表达率应该被关注,50%与70%、80%甚至90%,肯定是不同的,表达梯度的预实验不可忽视!

4.“上下求索”

“上下求索”出自屈原的长诗《离骚》,“路漫漫其修远兮,吾将上下而求索。” 到达目的地之路虽然模糊不清,但要不失时机的去探索而行。

立足一点,上下求索,或许可以能找到新的研究思维的突破口。其中,我们可以分成两部分来理解,1)生物合成的上下关系;2)信号通路的上下关系。

生物合成上,中心法则已被人们所熟悉,然而现在提出来了“新中心法则”的说法,把生成的蛋白质的对DNA或RNA的反向调控作用,提升到一个很高的位置,其中也包括了生成的蛋白质,在信号通路的调控作用。

同样,推荐三个常用的数据库给大家,Uniprot数据库可以在线查询、检索特定蛋白的功能域。Cell Signaling Technology 和QIAGEN是两个大型生物试剂公司,其中提供的信号通路信息十分有用。


以上是在QIAGEN网站下载的TGF-β和BMP信号通路的信号通路图,不仅图片高清,便于查询不同分子在信号通路中的位置,而且可以下载PPT格式,对信号通路图进行再编辑、再加工、再创作,无论是在基金项目申请还是文章撰写、绘图方面都可以加分!

5.“他山之石”

“他山之石”出自《诗经·小雅·鹤鸣》:“他山之石,可以攻玉。” 别的山上的石头,可以琢磨玉器。即比喻别国的贤才可为本国效力,也比喻能帮助自己改正缺点的人或意见。

基因研究中,分子流行病调查、遗传表型和性状相互关系等方面的研究也备受瞩目。比如2011日本RIKEN理化研究所的Ikegawa教授利用GWAS(Genome-wide association study)即全基因组关联分析技术,率先发现LBX1基因与青少年特发性脊柱侧凸之间的关系[2],随后,全世界范围内多个研究中心、研究团体对该基因在不同种群中进行验证[3-5],并进行Meta分析[6]


6.“旁征博引”

“旁征博引”是指说话、写文章时,为了表示论证引用很多的材料作为依据或例证。

我们经常通读、研究文献,对于一些重磅级文章,内心十分钦佩,其实这个时刻需要我们进行一些辩证的思考,借鉴和引用别人的方法和思路,比如说对于神经干细胞模型的研究,我们能否用于骨髓间充质干细胞的细胞模型,亦或是其它细胞模型。

那么已有的小鼠模型,能否在斑马鱼身上进行模型构建?进一步再去研究相关的功能和机制,会不会有新的突破?在上皮细胞或组织中的研究,在间质细胞或组织中又会有什么表现呢?只有做到这样才能“博观而约取,厚积而薄发”,思路方可打开。


7.“十面埋伏”

十面埋伏,这个成语典故出自楚汉相争的垓下之战,意思是设伏兵于十面以围歼敌军。我觉得该套路是对之前方法的一个拓展,如何做到“头脑风暴”,由点到线到面,一步步把研究思路拓展?

当前,对于基因的检测手段有很多,选择恰当、合理的检测手段并不是一件难事。但是,对不检测到突变或变异,要善于去思考和问自己,这个突变或变异,具体到哪个位点,是怎么样的突变形式,突变的功能变化是什么样的?突变后的蛋白,定位于那个功能域?影响蛋白怎么样的功能?是否会影响下游的转录因子或分子?受到怎么样的表观调控?会不会对不同的信号通路产生影响?一些列的问题,只要我们多去思考一下,就会发现很多的突破口。


经验总结:


“工欲善其事,必先利其器。”提前做好基因研究的预习和背景知识的研究十分必要。

“联系无处不在、联系无时不有。”用联系的观点看问题、选方向,联系交汇之处,往往也是新问题孕育之处!无论他人提供多少种方法、套路,关键是要有一套自己得心应手的思路。“孤证不立”,联合多种方法论证同一问题,可以丰富、强化自己的论证!

“一入基因深似海,从此萧郎是路人”,基因研究有风险,研究需谨慎。

参考文献:

1. Gao W, Chen C, Zhou T, et al. Rare coding variants in MAPK7 predispose to adolescent idiopathic scoliosis. Human mutation 2017.

2. Takahashi Y, Kou I, Takahashi A, et al. A genome-wide association study identifies common variants near LBX1 associated with adolescent idiopathic scoliosis. Nature genetics 2011;43:1237-40.

3. Gao W, Peng Y, Liang G, et al. Association between common variants near LBX1 and adolescent idiopathic scoliosis replicated in the Chinese Han population. PLoS One 2013;8:e53234.

4. Nada D, Julien C, Samuels ME, et al. A Replication Study for Association of LBX1 locus with Adolescent Idiopathic Scoliosis in French-Canadian Population. Spine (Phila Pa 1976) 2017.

5. Liu S, Wu N, Zuo Y, et al. Genetic Polymorphism of LBX1 Is Associated With Adolescent Idiopathic Scoliosis in Northern Chinese Han Population. Spine (Phila Pa 1976) 2017;42:1125-9.

6. Londono D, Kou I, Johnson TA, et al. A meta-analysis identifies adolescent idiopathic scoliosis association with LBX1 locus in multiple ethnic groups. Journal of medical genetics 2014;51:401-6.

作者简介:

陈崇

陈崇,医学博士,2008-2013年于广州医科大学就读临床医学专业,期间担任学生会主席并获“广州市优秀学生干部”殊荣。

2013年-2016年就读于中山大学,师从苏培强教授于附属第一医院专修脊柱外科,期间获“约翰霍普金斯大学临床研究培训证书”并以优异成绩考入北京协和医院,师从我国著名骨科专家沈建雄教授,继续攻读博士学位,进行脊柱外科疾病的临床与基础研究工作,尤其在脊柱畸形及脊柱退行性疾病的诊疗。

参与国家自然科学基金3项目及多项部委、省、市基金,多次获取国家及省、市奖学金,发表多篇SCI论文。

余可谊

余可谊,北京协和医院骨科副主任医师,副教授,青年工作部部长。

专业方向为脊柱外科,擅长脊柱畸形和脊柱微创手术,先后3次赴美国学习脊柱外科。

现为中国医师协会脊柱内镜专家委员会委员、 SICOT学会中国部微创脊柱外科分会委员、北京医学会骨科分会微创学组委员,并作为北京市自然基金评审专家和《脊柱外科》杂志通讯编委,《中华骨科杂志》、《中华骨与关节外科杂志》特约审稿人,担任骨科在线脊柱外科专业副主编,担任《The Spine Journal》中文版、《Spinal deformity》中文版编委。


沈建雄

沈建雄,主任医师,教授,博士研究生导师,北京协和医院骨科副主任。

在国内最早开展前后路一期手术治疗严重脊柱侧弯、前后路一期半椎体切除术,每年完成脊柱侧弯矫形手术近200例。

担任中国医药教育协会脊柱分会副主任委员、畸形学组组长,中国康复医学会脊柱畸形学组副组长,SRS委员,国际华人脊柱学会理事,《中国脊柱畸形杂志》副主编, Spine杂志编委,《生物骨科材料与临床研究杂志》常务编委,《中华骨与关节外科杂志》编委,《中华临床医学杂志》编委。

发表SCI论文60余篇,获国家科技进步二等奖,北京市科技进步二等奖,瑞士Muller奖;主持国家自然科学基金重点项目、面上项目,北京市重点项目,首发基金等。

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