要点：

细菌培养结果阴性仍然是诊断关节假体周围感染的现实挑战。

从受累的关节不能分离培养出感染致病菌有多种原因，其中最重要的原因是在获取培养标本前应用了抗生素。

可疑关节假体周围感染的病人在确定诊断前不应该应用抗生素，在最后一剂抗生素应用后推迟至少2周进行关节穿刺。

提高培养阳性结果的其它策略包括快速送检培养标本，组织或关节液标本放置在适当的培养基、假体进行超声处理和延长标本培养时间至2或3周。

对翻修前关节穿刺没有感染致病菌的病人，临床征象仍与关节假体周围感染相符，在翻修手术时建议最少取3到5块培养标本。

当标准技术不能确定感染病原体时，生物标记物和分子技术，譬如聚合酶链反应鉴定细菌DNA，在未来诊断关节假体周围感染可能会起到越来越大的作用。

关节假体周围感染是关节置换灾难性的并发症之一。虽然关节假体周围感染是不常见的并发症，据报告在美国发生率为1-2%，在医疗保险的人群中膝关节翻修最常见，而髋关节翻修是第三种最常见的现象。而且，关节假体周围感染的发生似乎在增加，到2020年预计要超过60,000到70,000人。

关节假体周围感染的诊断依赖于详细的病史和体格检查结合血清学检查及放射学检查回顾。另外，从关节液的培养或受累关节获取的组织中分离培养出感染性致病菌对选择恰当的抗生素治疗是至关重要的，并对预后提供一些见解。

根据肌肉骨骼感染学会最近提出的关于关节假体周围感染的定义：从关节周围获取的两个单独的组织或关节液标本中分离出相同的病原体可以确诊为关节假体周围感染。

然而，在7%至12%的病人中虽然具有明确感染的其它指证，譬如引流窦道或关节液白细胞(WBC)计数和分类明显增高，但细菌培养阴性。

细菌培养假阴性不仅对选择适当的抗生素治疗提出了挑战，而且也经常是病人和医生的焦虑之源，因为没有确定的病原菌医生怀疑诊断。对细菌培养阴性的关节假体周围感染的处理涉及到应用广谱抗生素或多种抗生素抑制常见的致病菌。

这种处理方法使病人处于机体中毒的风险中，也不能覆盖抑制真菌或少见致病菌。因此，尽一切努力分离培养出致病菌是关键。

关节假体周围感染细菌培养阴性的原因

据报告发生细菌培养阴性的关节假体周围感染为7%-12%不等。以前的研究凸显了不能分离出感染性致病菌的潜在原因。最重要的原因是从受累的关节获取关节液或组织样本前病人使用了抗生素。

Trampuz等的研究结果表明在获取培养样本前2周应用抗生素与培养阳性率低相关。关节假体周围感染细菌培养阴性的60例病人的其他报告中，Berbari等发现53%的病人在从受累的关节获取培养标本前曾接受抗生素治疗。

如果安全的话，在手术干预或培养前终止应用抗生素至少2周，可提高假体周围组织培养的敏感性;不易生长的微生物培养困难，甚至需要很长的培养时间。

而且，关节液WBC计数和分类是常用于诊断关节假体周围感染具有说服力的检查，在确诊或从关节获取关节液前应用抗生素可影响其准确性。

最后，研究表明关节置换术后切口引流时间延长(5天以上)也与关节假体周围感染病人细菌培养阴性风险增加有关，这很可能因为切口引流应用抗生素所致。

培养技术可能妨碍感染致病菌的确定。关节假体周围感染细菌培养阴性的原因之一是传统组织培养不能发现包裹在生物膜中的感染性致病菌。

在生物膜中细菌包裹在由大分子譬如多糖蛋白质复合物组成的复杂结构中，这些大分子使致病菌逃避了人体的免疫系统(巨噬细胞和中性粒细胞)。据估计这些固着菌比相应的浮游菌(自由漂浮)耐抗生素1000倍以上。

在慢性关节假体周围感染的大部分致病菌存在于生物膜中，粘附在假体表面及其周围组织中。后者解释了在这些病人中培养阳性率低，因为细菌培养要依靠分离出浮游菌。慢性关节假体周围感染没有自由浮游菌也解释了病人缺乏感染体征的原因。

在可疑关节假体周围感染的病人不能获得阳性培养结果的第二个原因是在实验室没有应用细菌生长和分离的专门培养基。不典型性致病菌，不能生长在常规需氧或厌氧的培养基，譬如真菌和结核杆菌，而丙酸菌属和凝血酶阴性的葡萄球菌需要一至二周的时间进行分离培养。

培养阴性的第三个原因是获取培养标本和送检标本的方法。从关节未感染部位获取标本，延迟了标本送检和组织的脱水或极度温度下的暴露影响了培养的结果。

关节穿刺物培养阳性率减少的第四个原因是导入了抑菌剂，譬如盐溶液或局麻药在抽吸时进入关节腔。如果在进行穿刺时，没有获取关节液，我们建议在关节另一部位再次抽吸。在获取培养标本前术中切开灌洗应用抑菌剂也可干扰致病菌的分离培养。

提高细菌培养阴性病人确定致病菌的策略(表I)

美国骨科医师协会(AAOS)髋膝关节假体周围感染诊断的临床指南强烈推荐反对在可疑关节假体周围感染的病人确诊前应用抗生素。正如先前面的讨论，这是降低关节假体周围感染细菌培养阴性的最有效方法。该指南也包含建议从关节获取培养物前至少2周停止应用抗生素，但是对于难于培养的一些致病菌可能需要更长的时间。

然而，在翻修手术前区别应用治疗性和预防性抗生素是重要的。很明显在获取关节深部培养物前不鼓励应用治疗性抗生素，翻修手术前给予预防性应用抗生素是细菌培养阴性关节假体周围感染的原因之一，其作用还不清楚。

认为常规应用预防性抗生素作为全关节置换预防关节假体周围感染强有力的手段是公认的标准。然而，传统的教程建议翻修手术前应该停止这些抗生素的应用，以免影响深部培养物的培养结果。

最近的两项研究挑战了这一观念，提议单剂预防性抗生素不会影响应用现代检测技术的培养结果。而且在进一步的检测下我们停止应用预防性抗生素，因为我们术前提高了“确定”或“排除”感染。

特别说明的是，AAOS临床实践指南中关于对关节假体周围感染的诊断，建议在翻修手术前所有病人测定红细胞沉降率(ESR)和C反应蛋白(CRP)水平，因为这些检测具有高度敏感性。

如果这些血清学标记物阴性，关节假体周围感染的风险非常低，由于预防性应用抗生素对术中培养物的影响较小，所以停止应用抗生素的风险相比之下可能要大。

同样的，如果ESR和CRP水平升高，或者临床感染的可能性增加，术前进行关节穿刺，绝大多数病人关节液WBC计数和分类的结果则肯定或排除感染。另外，关节液的培养结果也可确定诊断和鉴定致病菌。

所以，从获取的证据表明，不能在无菌状态下行关节翻修的病人和已经确定关节假体周围感染的病人，术前已经确定感染致病菌，术前应该接受预防性抗生素。只有强烈怀疑关节假体周围感染但是没有分离培养出致病菌的病人，术前才停止应用抗生素。

就如AAOS诊断关节假体周围感染的临床指南所建议的，在翻修手术时，手术医生应该从关节周围获取多个培养物。从髓腔或骨-植入物假体界面获取组织被认为可分离培养出致病菌的阳性率更高，关节液或组织直接培养比拭子培养阳性率更高。

用锐性器械自由分离切开而不用电刀切取组织，因为极端热量可能使组织坏死和干扰感染性致病菌的培养。用清洁器皿装入组织并直接送检至培养器皿，不允许标本接触手套、手术巾或其他物质的表面。后一策略似乎对降低培养假阳性是有效的，确保能培养出真正的感染性致病菌。

培养技术有特殊的规定。从关节恰当获取的组织或关节液标本，并立即处理。血液培养瓶改善了关节液标本的微生物检测，比常规琼脂培养基或肉汤培养基降低了污染。接种在血液培养瓶中的关节液能更快地鉴别出致病菌，敏感性和诊断的特异性更高。

如果怀疑真菌或结核菌感染，需要应用适当的送检瓶(无菌的螺丝帽培养管，Amies转运培养基，或Stuart转运培养基)和分离培养基(Lowenstein-Jensen改良罗氏生长基，Sabouraud琼脂，或脑心浸液琼脂)。有些机构也建议对所有培养标本应用富集培养基,譬如含绵羊血的胰酶大豆琼脂、巧克力琼脂、McConkey琼脂或脑心浸液肉汤。

其他提高细菌培养阳性率的策略是延长标本的培养时间至14天或可能21天。计划保持培养14天的标本，如果不能分离培养出感染致病菌，应该延长培养21天，以便培养出生长缓慢的致病菌，譬如分枝杆菌和一些真菌。

根据培养时间把分离培养的菌群分为两类：主要存在于培养第一周内的早期菌群和培养第二周检测到的晚期菌群。虽然一些机构推荐对所有培养标本都常规培养14天，但是我们相信术前不能确定致病菌的病人经过更长的标准时间培养后是有用的。

超声处理保留的假体是破坏生物膜暴露感染致病菌和提高细菌培养结果的一种方法。超声处理增加了致病菌的化学降解，而且破坏了细菌细胞壁的结构和渗透性，显示能够保持细菌的活力。

据报告超声处理比常规方法具有更高的敏感性。其优势包括在改善致病菌的培养阳性率和药物敏感试验方面具有方法简单、可重复性和有效性。但该方法存在效用性的缺陷。

分离培养感染致病菌新的分子技术

近年在普通分子生物学领域，尤其在生物标记领域取得了巨大发展。生物标记物是感染致病菌或由感染激活的免疫细胞的副产物。

我们最近报告了应用白细胞酯酶试纸检测关节假体周围感染。白细胞酯酶试验对诊断关节假体周围感染具有100%的特异性和100%的阳性预测价值。这一简单和价廉的试验效果是确定的，虽然该试验受关节内血液或组织碎片的影响，以至于难以读出比色色度的试验结果，或多或少具有主观性。应用白细胞酯酶试纸可以精确诊断细菌培养阴性的关节假体周围感染。

对可疑关节假体周围感染的病人也有测定关节液CRP水平或其它生物学标记的报告。应用生物标记替代物的下降不能确定感染致病菌，所以不能进行药物敏感试验来指导抗生素的治疗。

聚合酶链反应(PCR)是一种通过一系列指令扩增DNA，产生成千上百万的特异DNA复制序列的生物化学方法。作为检测假体周围感染的具有潜力的方法得到了获得了令人兴奋的发展。

根据这一技术是利用种属特异性引物或宽序列的引物碱基对16S核糖体核糖核酸(16S rRNA)的PCR扩增。根据PCR分析可产生良好的结果，并且已经建议作为一种消除关节液培养假阴性率高的可供选择的方法。

虽然根据PCR分析可提高对细菌培养阴性病例的培养敏感性，但是在实际应用中，由于种种原因这一技术的实际应用还比较受限，包括培养假阳性率较高、技术仪器要求高和费用高。

细胞死亡后或在精制的重组试剂中细菌污染导致细菌DNA持续存在，推断极度的敏感可能是结果假阳性率高的最重要原因，因此临床医生不能信奉这一技术。

为提高这一分子技术的特异性和降低假阳性结果，基于PCR技术的RNA得到了应用。理论上讲，根据这一方法RNA更具选择性，原因是RNA不稳定易于分解，这主要是与活菌有关。

已有报告称基于PCR技术，由于测定了非活性基因组DNA，应用信使RNA(mRNA)几乎能消除产生的假阳性结果。然而，临床标本细菌中mRNA转录量少(低于RNA总量的1%)，并且细胞死亡后mRNA降解率高，限制了该技术的应用。

相反，推荐应用基于PCR的rRNA的技术，由于其优越性，包括细菌rRNA成出量高(大于RNA总量的95%)、特异性接近100%和相当于术中培养的敏感性。已经开发了特异性靶点耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的mecA基因，产生了令人鼓舞的结果。

最近我们应用了生物感应器Ibis T5000(卡尔斯巴德，加利福尼亚)，它是基于PCR技术的多重聚合酶链反应，它应用了多重种属特异性的引物而不是通用引物来扩增某一细菌的基因，以提高细菌培养阴性的关节假体周围感染的诊断，从而确定感染的致病菌。

应用这一技术确定耐药基因可在下列病人中进行鉴别：感染和培养阳性结果、感染和细菌培养阴性、关节假体周围可疑感染而没有感染。

另一项有趣的技术是PLEX-ID (伊利诺斯州，Abbott实验室)，最初是根据类似电喷射打靶技术，从3100种已知细菌的标本中来确定感染的致病菌。该装置利用高分辨亚型和耐药谱能确定感染致病菌的特征，包括耐甲氧西林特性的mecA基因。

细菌培养假阳性

虽然关注了细菌培养阴性的关节假体周围感染，但是诊断细菌培养假阳性的关节假体周围感染同样重要。就如先前概述的一样，有些人认为传统培养是诊断的所谓金标准，这有很大的缺陷。

为了降低细菌培养假阳性结果的风险，处理要培养的组织标本至关重要。尤其是术中应用清洁器皿获取的标本要直接放于无菌的培养瓶或培养杯，而不接触手套、手术巾和隔离衣。

在临床医生没有考虑现有的其他诊断情况下，而病人的培养结果不能解释，认识到这一点很重要。AAOS临床指南强烈推荐：如果血清学检查不正常，翻修手术前要进行关节穿刺，因此大部分关节假体周围感染的病人术前应该确诊。

特别说明的是，如果ESR和CRP都正常，培养结果阳性或可疑，那么感染的风险很低。而且，如果血清学检查不正常，术前要进行关节穿刺，临床医生要进行关节液WBC计数和分类(就和术前培养一样)。如果全部检查都阴性，感染可能性就不大。

假体周围组织的组织病理学检查是诊断关节假体周围感染的另一种很有价值的工具，并且有助于临床医生适当考虑培养假阳性的可能。而且，AAOS临床指南强烈推荐术中要进行多次培养。

如果能进行三到五次的培养，则能极大地帮助解释培养结果，特别是对于仅有一次培养阳性，而其它次培养阴性。最后，疾病感染专家对帮助确定培养是否假阳性具有不可估量的价值。

细菌培养可疑阴性的关节假体周围感染病人的实用方法

临床医生在面对病史、体格检查、血清学结果和关节液分析都提示感染的病人时，但是术前穿刺培养初次阴性，以下步骤可能是有帮助的。

首先，重新进行关节穿刺，同时确保病人至少两周没有应用抗生素。送检获取的关节液进行有氧和无氧培养，同时进行真菌和抗酸杆菌的特异性培养。穿刺的关节液也应送至血液培养瓶。标本应直接送至实验室并且根据瓶条进行迅速处理标本。

外科医生要和微生物实验室进行沟通，实验室经常由感染疾病专家指导，可进一步指导帮助延长培养(14天至21天)，可能建议特殊培养基。最后，临床医生应始终仔细探问旅游或居住在致病菌流行区病人的详细病史，可能会暗示非典型致病菌的感染，譬如球孢子菌感染。也应该进行血液检查确定该致病菌的存在。

如果进行了上述所有检查，翻修术前仍然没有检测出致病菌，术前应该咨询疾病感染专家。这要考虑病人由其他专家进一步确定诊断，允请感染疾病专家不仅是术前通晓告知病例(有助于抗生素的选择)，而且也有助于指导术中获取的培养物的处理。

细菌培养阴性的关节假体周围感染的病人翻修手术时，要在全身应用抗生素前在高度怀疑的感染区域切取3至5块组织标本进行培养。切取的组织标本如上所述以应急的方式进行处理。如果可能的话对保留的假体应该进行超声处理。五块组织标本应该作为永久切片保存进行组织病理学分析以进一步确定关节假体周围感染的诊断。

因此，细菌培养阴性的关节假体周围感染对临床医生和病人提出了挑战，可能占关节置换感染病人的10%。对这些病人中不能应用针对性的抗生素治疗感染性致病菌，必须进行广谱抗生素的治疗，此时多种抗生素的应用增加了病人全身毒性的风险。

有多种原因不能从受累的关节中分离培养出感染致病菌，其中最重要的原因是在获取深部培养物前应用了抗生素。另外的原因是传统的组织培养不能获取包裹在生物膜中的感染致病菌，当怀疑非典型性病原体譬如真菌和结核杆菌，而没有应用特异性培养基来接种和分离。

AAOS临床指南指出，关节假体周围感染可疑病人在诊断确定或排除前不能应用抗生素。另外，在应用最后一剂抗生素至少2周后推迟进行关节穿刺。

高度怀疑关节假体周围感染，如果存在细菌培养阴性和穿刺没有阳性结果及炎性标记物升高，应该进行关节重复穿刺。应用多种策略提高培养的阳性率，包括迅速送检培养标本，在无菌状态下培养，把组织或关节液放在适当的培养基，延长标本的培养时间，对非典型性致病菌譬如真菌和结核杆菌应用富集和特异性培养基。寻求感染疾病专家的帮助也具有不可估量的作用。

参考文献 略