余永涛  廖烨晖  唐强  彭道琥  钟德君

目的：研究硫酸软骨素酶ABC（chondroitinase ABC，ChABC）、Nogo-66受体拮抗剂[Nogo-66（1-40） antagonist peptide，NEP1-40]及鼠胚神经干细胞（neural stem cells，NSCs）联合移植对大鼠损伤脊髓功能恢复的影响。

方法：体外应用全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）（浓度1.0μmol/L）诱导NSCs（前期实验分离、培养并冻存的鼠胚NSCs），诱导后鉴定NSCs特异性标志物，移植前通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyUridine，Brdu）标记NSCs。将60只SD大鼠随机分为假手术组（A组，n=10）、损伤对照组（B组，n=10）、NSCs治疗组（C组，n=10）、NSCs联合ChABC治疗组（D组，n=10）、NSCs联合NEP1-40治疗组（E组，n=10）、NSCs联合ChABC和NEP1-40治疗组（F组，n=10）。移植前分别对B、C、D、E及F组的大鼠制作胸段脊髓全横断损伤模型。术后3d，E和F组经留置的导管注入NEP1-40 20μl/d，连续28d；术后8d，C、D、E及F组经留置导管注入经ATRA干预和BrdU标记的NSCs 10μl；术后8d，D组和F组经留置导管注入ChABC 10μl/d，连续7d；各时间点通过留置导管注入生理盐水保持各组移植液等量。术前及术后不同时间点，用BBB评分和体感诱发电位（somatosensory evoked potentials，SEP）潜伏期对大鼠后肢神经功能进行评价。移植后8周通过HE染色观察损伤脊髓组织情况，免疫荧光染色观察移植NSCs存活、神经元分化及轴突生长情况。

结果：体外应用1.0μmol/L的ATRA诱导NSCs培养，可提高NSCs向神经元分化的比例。移植后2周开始各组大鼠BBB评分、SEP潜伏期开始观察到改善，移植治疗各组均优于损伤对照组，组间BBB评分和SEP潜伏期有差异（P<0.05）；移植后2周、5周、8周各时间点，B组与C、D、E及F组比较，BBB评分和SEP潜伏期较差（P<0.05）；在移植治疗各组中，F组神经功能的恢复最明显，F组与C、D及E组比较具有较高的BBB评分和较短SEP潜伏期（P<0.05）。移植后8周，HE染色显示：A组细胞结构完整、排列规则；B组组织结构严重破坏，细胞排列紊乱，见大量较大的囊腔及胶质瘢痕形成；C、D、E及F组细胞增生明显，囊腔较少。免疫荧光染色显示：C、D、E及F组内可见橘红色Brdu标记阳性细胞，F组阳性细胞数多于C、D和E组，差异具有统计学意义（P<0.05）。C、D、E、F组微管相关蛋白-2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）标记阳性细胞数多于B组，F组多于C、D、E组，差异有统计学意义（P<0.05）；C、D、E、F组MAP-2标记阳性细胞面积大于B组，F组大于C、D、E组，差异有统计学意义（P<0.05）。

结论：ATRA诱导后NSCs移植可促进大鼠脊髓损伤功能的恢复，且联合ChABC和NEP1-40移植对损伤脊髓功能的恢复具有协同促进作用。