阮洪江  范大鹏  陈帅  李旭军  范存义

目的 探讨miRNA219-5P（miR219-5P）调控Smad4在TGF-β1诱导人肌腱成纤维细胞（tendon derived fibroblasts，TDFs）纤维化过程中的作用。

方法 取患者自愿捐赠的肌腱组织分离培养TDFs，取第3代细胞进行实验。化学合成miR219-5P类似物（mimics）、阻遏物（inhibitor）及阴性对照序列，分别转染TDFs 48 h后，采用实时定量PCR及Western blot法分别检测miR219-5P基因及 Smad4蛋白表达情况；以正常细胞作为空白对照。信息学软件预测miR219-5P与Smad4基因3’UTR区结合位点，构建Smad4预测基因3’UTR-PGL3 重组质粒，构建野生型及突变型报告基因表达载体，并通过荧光素酶报告基因实验进行靶位验证。取正常及转染后TDFs，采用TGF-β1诱导细胞发生纤维化，于培养24、48、72 h采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖活性变化，72 h时采用Western blot法检测纤维化相关蛋白指标。

结果 miR219-5P mimics转染TDFs可明显上调miR219-5P表达、下调Smad4蛋白表达，而miR219-5P inhibitor抑制细胞内miR219-5P表达、增加Smad4蛋白表达，与空白对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。荧光素酶实验显示，与pGL3-WT-Smad4转染组比较，pGL3-WT-Smad4+mimics转染组细胞内荧光素酶活性降低、pGL3-WT-Smad4+inhibitor转染组活性增强（P<0.05）；而pGL3-MT-Smad4+mimics转染组、pGL3-MT-Smad4+inhibitor转染组组间比较无明显变化（P>0.05）。与空白对照组比较，TGF-β1诱导培养72 h后细胞增殖活性明显增强（P<0.01），同时上调细胞纤维化相关蛋白指标的表达（P<0.01）；与直接诱导组比较，miR219-5P过表达且诱导组TDFs细胞增殖活性和纤维化蛋白指标升高趋势得到抑制，而miR219-5P表达抑制且诱导组细胞增殖活性和纤维化蛋白指标则进一步增强，差异有统计学意义（P<0.01）。

结论 miR219-5P可通过抑制其靶基因Smad4表达，显著抑制TGF-β1诱导TDFs纤维化。