梁相辰  孙建华  卞正君  邵辉  黄朝庆  李相晨  于洋

目的 探讨兔纤维环细胞复合KLD-12多肽纳米纤维凝胶体外培养的可能性，寻找修复椎间盘退变的理想种子细胞和支架。

方法 胰蛋白酶消化法提取6月龄新西兰大白兔纤维环细胞，培养至第3代，复合于KLD-12多肽制备KLD-12多肽/纤维环细胞凝胶。倒置显微镜观察凝胶内细胞形态变化；细胞计数试剂盒8（cell counting kit 8，CCK-8）法检测细胞增殖活性；钙黄绿素（Calcein-AM）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）双荧光染色观察凝胶内活、死细胞，计算活细胞比率；阿尔新蓝法检测培养基中糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）含量；免疫荧光染色观察Ⅱ型胶原分泌情况；实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）检测纤维环细胞Ⅱ型胶原及蛋白聚糖（Aggrecan）基因表达情况。

结果 复合于凝胶中的纤维环细胞呈圆形，少部分在凝胶边缘处贴壁的细胞呈多角形。CCK-8结果显示，细胞增殖活性随培养时间延长呈增加趋势，培养14 d活性显著高于其余各时间点（P<0.05），且各时间点活性均显著高于空白凝胶对照组（P<0.05）。Calcein-AM/PI双荧光染色观察示，培养5、14 d凝胶内细胞活细胞比率分别89.32%±8.58%和97.81%±1.09%，比较差异无统计学意义（t= — 1.962，P=0.097）。GAG检测示，细胞中GAG含量随培养时间延长逐渐增加，8 d达峰值，之后逐渐下降；培养5、8、11 d时GAG含量显著高于2、14 d时（P<0.05）。免疫荧光染色示细胞中Ⅱ型胶原正常分泌。RT-qPCR检测示，培养5、14 d凝胶内纤维环细胞均可见Ⅱ型胶原和Aggrecan基因表达，14 d时基因相对表达量均显著高于5 d时（P<0.05）。

结论 纤维环细胞能够在KLD-12多肽纳米纤维凝胶中正常生长增殖，主要细胞外基质成分可正常表达，细胞生物活性良好。