张广德  苏成帅  靳霞  杨世茂  房殿吉  郭延伟

目的 探讨重组腺病毒介导BMP-9及促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）双基因共转染对脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）体外成骨分化的影响。

方法 取4月龄新西兰兔腹股沟脂肪组织，采用酶消化法与贴壁法分离培养ADSCs并鉴定其多向分化能力。将第3代ADSCs分为5组：A组为正常细胞，B 组为空质粒转染细胞作为对照，C、D组分别采用BMP-9、EPO重组腺病毒转染细胞，E组采用BMP-9、EPO重组腺病毒共转染细胞。转染培养7 d后倒置相差显微镜观察各组细胞生长变化；计算48 h时病毒转染效率，14 d荧光显微镜下观察各组细胞荧光表达情况；14 d时 Western blot检测各组细胞BMP-9及EPO蛋白表达。取转染培养14 d的5组细胞进行成骨诱导培养，于诱导培养3、7、14 d检测各组细胞ALP活性；3周时茜素红染色观察钙结节形成情况，实时荧光定量PCR检测骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨钙素（osteocalcin，OCN）基因表达。

结果 转染培养7 d后倒置相差显微镜下见A、B组部分细胞变为椭圆形、圆形和不规则形；C、D组可见少量长梭形细胞；E组长梭形细胞明显增多，仅见少量圆形细胞。荧光显微镜下观察BMP-9、EPO及BMP-9/EPO重组腺病毒均能稳定转染ADSCs，转染效率为80%～93%。Western blot检测示E组BMP-9及EPO蛋白相对表达量显著高于其他组，差异有统计学意义（P<0.05）。成骨诱导培养3、7、14 d时各组细胞ALP活性明显升高，E组优于其余各组（P<0.05）；3 周时茜素红染色示E组钙结节数亦显著高于其余各组（P<0.05），实时荧光定量PCR示E组OPN和OCN基因相对表达量明显高于其他组，C、D组高于A、B组，比较差异有统计学意义（P<0.05）。

结论  重组腺病毒介导BMP-9及EPO基因均可转染ADSCs并稳定表达，双基因共转染后能显著促进成骨相关基因和蛋白的表达。