徐良  刘璠  朱建炜  朱立帆  蒋富贵

目的：研究胞浆泛素蛋白连接酶2 （Kip1 ubiquitylation-promoting complex 2，KPC2）在大鼠脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）过程中的蛋白表达及细胞定位情况，探讨其在SCI修复过程中的生物学功能。

方法：将成年SD大鼠随机分为2组，对照组7只仅行单纯T9椎板全切除术，实验组49只采用改良Allen法制作T9节段脊髓撞击损伤模型，实验组于伤后6、12 h及1、3、5、7、14 d分别取7只大鼠进行以下检测。采用Western blot检测p27kip1、KPC2、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和细胞周期蛋白A（CyclinA）在SCI前后的蛋白表达变化，免疫组织化学染色观察KPC2在SCI后的大体定位及表达，免疫荧光双标记染色观察KPC2在SCI过程中与神经元特异性核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）、神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和PCNA的共定位情况。细胞水平采用体外培养星形胶质细胞增殖模型，Western blot检测KPC2、P27kip1、PCNA表达；免疫共沉淀分析KPC2、KPC1和p27kip1之间在细胞增殖过程中的相互作用。

结果：Western blot结果示SCI后3 d，p27kip1显著下调，伴随KPC2、CyclinA、PCNA表达明显增加。免疫组织化学染色示KPC2阳性信号广泛分布，包括脊髓灰质和白质，实验组KPC2阳性细胞数显著高于对照组（t=10.982，P=0.000）。免疫荧光双标记染色示在脊髓灰质，对照组和实验组KPC2与NeuN双标记阳性细胞数分别为（0.43±0.53）、（0.57±0.53）个/视野，比较差异无统计学意义（t=0.548，P=0.604）；在脊髓白质，对照组和实验组KPC2与GFAP双标记阳性细胞数分别为（3.86±0.90）、（0.71±0.49）个/视野，差异有统计学意义（t=7.778，P=0.000）；对照组和实验组KPC2与PCNA标记的星形胶质细胞共定位明显，阳性细胞数分别为（0.57±0.53）、（5.57±1.13）个/视野，差异有统计学意义（t=8.101，P=0.000）。体外培养并模拟星形胶质细胞增殖，提取细胞蛋白行Western blot示PCNA和KPC2蛋白表达在血清刺激增殖后即开始增加，24 h达峰值，而p27kip1表达则逐渐减少。免疫共沉淀示KPC2可沉淀p27kip1、KPC1，p27kip1也可沉淀KPC2、KPC1，且在刺激后相互作用明显增加。

结论：SCI后KPC2参与介导的p27kip1表达下调，KPC2与SCI后星形胶质细胞的增殖相关。