王汉邦  陶晖  申才良  李海太

目的：观察酸环境对体外培养的成人髓核间充质干细胞（NPMSCs）生物学特征的影响，探讨椎间盘退变的可能机制。

方法：用胶原酶消化法从6例脊柱侧凸矫形患者手术摘除的6个腰椎间盘（Pfirrmann椎间盘退变分级为Ⅰ级或Ⅱ级）髓核组织中分离细胞，体外培养，传代并观察细胞形态。取P2代细胞，利用流式细胞仪对分离得到的细胞表型CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和人类白细胞抗原（HLA）-DR表达情况进行检测；用成骨、成软骨、成脂培养液诱导培养细胞，2周后分别用茜素红、甲苯胺蓝、油红O对细胞进行染色，观察其成脂、成骨、成软骨能力。按照国际干细胞治疗协会（ISCT）有关间充质干细胞（MSCs）的判定标准，对分离得到的细胞进行综合评估鉴定。在37℃、21%O2、5%CO2的细胞培养箱中用不同pH值（6.2、6.5、6.8、7.1、7.4）的DMEM10%血清培养液培养P2代细胞，1、3、5、7、9、11、13d后利用细胞增殖试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）检测细胞增殖活力（OD值），培养3d时借助流式细胞仪检测细胞凋亡率，不同pH值培养基培养28d时采用实时荧光定量（RT-PCR）检测P2代细胞“干性维持”基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的mRNA表达情况。

结果：P0代细胞均贴壁生长。P2代细胞免疫表型鉴定显示MSCs表面分子标记CD90、CD105、CD73表达比例分别高达96％、95％、94%以上，低表达CD45、CD34、HLA-DR（均低于4%）。茜素红染色、油红O染色及甲苯胺蓝染色分别证实分离的细胞均可向骨、脂肪及软骨细胞三系诱导分化。按照ISCT有关MSCs的判定标准，分离得到的细胞即NPMSCs。细胞代谢活性测定示P2代细胞在培养后1、3d各组间细胞OD值差异无统计学意义（P＞0.05）；5d、7d、9d、11d、13d各组间细胞OD值差异有统计学意义（P<0.05），且pH值越低细胞的OD值越小。pH值7.4组的细胞凋亡率均小于其余各组，各组间有统计学差异（P<0.05）。pH值7.4组“干性维持”基因Oct4、Nanog、Jag1、Notch1及酸离子通道家族蛋白基因ASIC1、ASIC2、ASIC3、ASIC4的mRNA均明显高于pH值7.1、6.8、6.5、6.2组（P<0.05）。随着培养液pH值降低，细胞的凋亡率升高，细胞干性维持基因及酸通道家族蛋白基因的mRNA表达降低。

结论：低pH值的酸环境培养1、3d对成人NPMSCs增殖无明显影响，培养5d后明显抑制NPMSCs的增殖和基因表达，促进细胞凋亡，且随着pH降低作用越明显。