目的脂肪细胞和成骨细胞的分化存在相互制约的平衡关系。近年来研究表明脂肪细胞和成骨细胞的分化受表观遗传机制包括miRNA的调控。本研究将探讨miR-30e对脂肪细胞与成骨细胞分化的影响及其作用机制。

方法1.miRNA芯片技术检测miRNA在小鼠骨髓MSCs成骨和成脂分化过程中的差异表达，real-timePCR检测几种不同前体细胞向脂肪细胞和成骨细胞分化过程中miR-30e的表达变化。2.在3T3-L1细胞中增强miR-30e表达或抑制miR-30e表达，检测miR-30e对3T3-L1细胞增殖与分化的影响；在MC3T3-E1细胞中抑制miR-30e表达，检测miR-30e对成骨细胞分化的影响。3.结合生物信息学方法和双荧光素酶报告基因实验鉴定miR-30e的靶基因。通过基因功能缺失性研究探索候选靶基因调节细胞分化的作用机制。

结果1.通过miRNA芯片结合real-timePCR方法发现miR-30e诱导成脂后表达显著上升，同时在诱导成骨后显著下降。2.在3T3-L1细胞内增强miR-30e表达，细胞生长受抑制而分化加强，脂肪细胞分化关键转录因子PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ和表征基因aP2等表达显著升高。相反，抑制3T3-L1细胞内源性miR-30e表达则可促进细胞增殖并抑制3T3-L1分化为成熟脂肪细胞。在前成骨细胞MC3T3-E1细胞，抑制内源性miR-30e表达促进细胞分化成熟，Runx2、Osx、Osteocalcin、ALP和BSP等基因表达显著升高。3.成功构建了包含miR-30e应答序列的Runx2、Wnt7b和Lrp6的3’UTR的重组报告载体，荧光素酶报告基因测定证实了miR-30e能够结合Lrp6的3’UTR而阻断其表达。在3T3-L1细胞内下调Lrp6表达后，β-catenin/TCF信号减弱。细胞分化研究进一步证明Lrp6表达下调可以促进3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞，脂肪细胞特异性基因表达显著升高。

结论1.miR-30e在脂肪细胞分化过程中表达上升，而在成骨细胞分化过程中表达下降。2.miR-30e可以抑制脂肪细胞增殖而促进脂肪细胞分化，并抑制成骨细胞分化。3.Lrp6为miR-30e的靶基因，Lrp6负性调节脂肪细胞分化，miR-30e通过靶向抑制Lrp6表达而促进脂肪细胞分化。