siRNA技术靶向沉默软骨细胞leptin受体Ob-Rb基因表达

2015-05-29   文章来源:四川大学华西医院骨科 郑果 唐新 李棋 付维力 陈刚 李箭     点击量:278 我要说

  目的:采用siRNA技术靶向沉默软骨细胞leptin受体Ob-Rb基因表达,抑制前炎性因子的表达及leptin下游信号传导,最终抑制关节软骨破坏,从而为临床OA的基因治疗提供实验基础及新思路。

方法:1. 人关节软骨细胞的获取及培养:
  取全膝关节置换术的 OA 患者股骨髁及胫骨平台关节软骨。标本取下后立即分离消化得到关节软骨细胞,用含20%胎牛血清(FBS)的常规培养基培养。
  2. 人关节软骨细胞的观察和鉴定:
  原代培养细胞生长融合率达90%以上进行1:3传代培养操作,倒置显微镜下观察各代细胞形态学特征,同时准备细胞爬片对各代细胞II胶原免疫组化染色、甲苯胺蓝染色及番红O染色行细胞鉴定。
  3. 人关节软骨细胞转染
  1) 通过生物信息学获得人leptin受体Ob-Rb的基因序列,设计靶向Ob-Rb基因的siRNA(设计合成3组)
  2)优化转染条件,摸索对人关节软骨细胞最佳的转染条件
  3)人软骨细胞转染

  a、实验分组,在软骨细胞培养到70-80%聚集时进行转染
  组一、将3组Ob-Rb siRNA转染关节软骨细胞
  组二、相应阳性对照siRNA转染关节软骨细胞
  组三、相应阴性对照siRNA转染关节软骨细胞
  组四、关节软骨细胞空白对照组,不加任何转染试剂
  采用RT-PCR和实时荧光定量PCR(Q-PCR)技术筛选出Ob-Rb沉默效果最好的一组siRNA进行后期实验(实验分组同前)。
  b、各组分别在转然后24、48、72小时应用Q-PCR/Western Blot检测Ob-Rb基因mRNA及蛋白的表达量、应用Western Blot检测collagen II基因的蛋白表达量、应用RT-PCR检测前炎性因子基因(INFγ,NO、IL-1β、和 MMP-1)的mRNA表达量。

  结果:经过筛选得出siRNA1的沉默效果是最好的。转染后实验组与对照组比较不同时间点Ob-Rb的mRNA及蛋白较表达均有降低,四种前炎性因子的mRNA也有不同程度的下降,而collagen II的蛋白表达量则有不同程度的上升。

  结论:采用siRNA可下调OA患者膝关节软骨细胞Ob-RbmRNA及蛋白表达量,并阻断 leptin对下游前炎性因子的诱导作用,促进collagen II的合成,减轻关节软骨的破坏,为OA的治疗提供了潜在的新思路。

  关键词:骨关节炎;leptin;受体;转染;软骨

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