杜清峰　　张海宁　　王英振　　吕成昱　　刘英魁

　　目的:探讨慢病毒介导的agggrecanase-2 shRNA对类风湿关节炎患者软骨细胞aggrecan的影响。

　　方法:术中切取类风湿关节炎患者关节软骨，通过胰酶+Ⅱ型胶原酶两步消化法消化软骨块并培养，取第2~3代软骨细胞。以慢病毒为载体将aggrecanase-2 shRNA5~8转染进入软骨细胞，观察转染后细胞的生长变化；以荧光定量PCR检测转染后第2、5、10天aggrecanase-2 mRNA水平的变化及aggrecan mRNA水平的变化，以循环阈值（cycle threshold，Ct）表示；用免疫组织化学方法检测aggrecan蛋白水平的变化，以积分光密度（integral optical density，IOD）表示，筛选最佳抑制序列。

　　结果:以慢病毒为载体介导aggrecanase-2 shRNA转染软骨细胞后对细胞生长速度及形态无明显影响。加入病毒液200 μl、100 μl、50 μl后感染复数分别为100、50、25，转染效率分别为90%、60%、30%。转染后aggrecanase-2 mRNA的表达水平明显下降，特别是mRNA5，由开始的0.876 3±0.115 6 下降至0.069 9±0.015 1（P＜0.05）；aggrecan mRNA 水平显著上调，由开始的0.992 1±0.201 3增加至3.049 2±0.278 2（P＜0.05）；aggrecan蛋白表达水平显著提高，由开始的496.160 5±225.673 7 增加至4 525.433 0±1 131.813 0（P＜0.05）；最佳抑制序列为aggrecanase-2 shRNA5。

　　结论:以慢病毒为载体介导aggrecanase-2shRNA转染骨关节炎患者软骨细胞可有效干扰aggrecanase-2 mRNA表达，相应地增加aggrecan表达，是一种保护aggrecan的有效途径。