许胜贵     林建华    刘蔚楠    吴朝阳

摘要:目的构建 BMP-2基因重组慢病毒载体，并检测其转染猪BMSCs 后BMP-2表达活性及诱导BMSCs成骨分化情况，为进一步构建组织工程骨软骨奠定基础。 方法取2只2月龄巴马香猪（体重约15 kg）髂骨骨髓，采用密度梯度离心法分离培养BMSCs，并传代。利用基因重组技术构建 BMP-2基因重组慢病毒载体，并以感染复数（multiplicity of infection，MOI）10、25、50、100、200转染第2代BMSCs，通过荧光显微镜及倒置相差显微镜观察确定最佳MOI值。以最佳 MOI 值感染 BMSCs作为实验组，空载体转染的 BMSCs（空载体组）及未转染的 BMSCs（空白组）作为对照，通过 RT-PCR、免疫组织化学染色、Western blot检测 BMP-2 mRNA及蛋白在 BMSCs 中的表达，并应用ALP染色、ALP活性检测及茜素红钙结节染色检测其成骨分化情况。 结果经RT-PCR基因测序鉴定 BMP-2基因重组慢病毒载体构建成功，转染 BMSCs后荧光显微镜下可见绿色荧光表达，且MOI值为 100 时为最佳表达。RT-PCR 提示 BMP-2 基因成功转染至 BMSCs 中；免疫组织化学染色及 Western blot检测示转染后BMSCs并可持续、稳定、高效表达 BMP-2蛋白；培养后2周BMSCs可见ALP表达及钙结节形成。 结论成功构建 BMP-2基因重组慢病毒载体并转染猪 BMSCs，BMP-2 基因转染入 BMSCs 后能持续、稳定、高效表达 BMP-2 基因和蛋白，并成功诱导 BMSCs 向成骨细胞分化。