阳运康       蒋电明      阳明明

摘要:目的 探讨人源性角质细胞生长因子2（human keratinocyte growth factor 2，hKGF-2）对体外长期培养人胚神经干细胞（human neural stem cells，hNSCs）存活和分化的影响。 方法 将液氮冻存17代hNSCs复苏常规培养7 d形成神经球后，取少许行免疫细胞化学染色鉴定干细胞及分化细胞特异抗原。一部分神经球浓缩后种植至12孔培养板中，分为7组，每组6孔，均添加1 mL基础培养液[含N2（1∶100）、20 ng/mL EGF的DMEM/F12培养基]后，B、C、D、E、F组分别添加10、30、60、90、120 ng/mL KGF-2，G组添加10 ng/mL bFGF，A组为空白对照组；培养7、14 d观察并计数神经球与hNSCs，了解神经球生长与增殖情况。另一部分浓缩后种植至置有多聚赖氨酸包被玻片的6孔培养板内，分为4 组，每组6孔，均添加3 mL DMEM/F12培养基后，A1、B1、C1、D1组对应加入N2（1∶100）、N2（1∶100） + 90 ng/ mL hKGF-2、FBS（1∶20）、FBS（1∶20）+ 90 ng/mL hKGF-2；培养14 d内观察神经球生长与分化情况。7 d时各取5 孔玻片行免疫荧光细胞化学鉴定和流式细胞仪检测，分析神经球的生长与分化状况。 结果 复苏后培养形成的神经球含大量巢蛋白阳性细胞，充满整个神经球；诱导分化后表达分化细胞特异性蛋白神经丝200（neurofilament 200，NF-200）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。各组神经球培养7 d后均有不同程度增大；随hKGF-2浓度增加，神经球数量和hNSCs数目均依次增多，呈递增趋势，E、F、G组显著高于A、B、C、D组（P < 0.05）；B、C、D组间两两比较差异亦有统计学意义（P < 0.05）；但A、B组间以及E、F、G组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。体外诱导过程中，A1、B1、C1、D1组分化细胞生长旺盛程度呈递增趋势，组间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；B1组NF-200阳性率显著高于其余3组（P < 0.05），GFAP阳性率显著低于其余3组（P < 0.05）；A1、C1、D1组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。培养14 d后各组生长均达峰值，以星形细胞为主。 结论体外培养17代的hNSCs系纯化hNSCs，hKGF-2能促进其增殖和诱导分化为神经元细胞。